PCR基因擴(kuò)增儀的工作原理及保養(yǎng)

  PCR基因擴(kuò)增儀的工作原理： PCR反應(yīng)一般設(shè)置20~40次循環(huán)，每一循環(huán)包括高溫變性、低溫退火、中溫延伸三步反應(yīng)。每一循環(huán)的產(chǎn)物作為下一個循環(huán)的模板。PCR的擴(kuò)增效率很高，如果循環(huán)次數(shù)是30次，那么新生DNA片段理論上達(dá)到230拷貝(約為109個分子)。 PCR反應(yīng)每個循環(huán)的三個基本反應(yīng)步驟如下：①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至94℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA產(chǎn)物解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備;②模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結(jié)合;③引物的延伸：溫度升到72℃左右，DNA模板-引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留復(fù)制鏈。重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需 2～4分鐘，2～3小時就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍。到達(dá)平臺期(Plateau)所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。 PCR技術(shù)的特異性取決于引物與模板結(jié)合的特異性。 PCR儀也叫基因擴(kuò)增儀，它是利用PCR技術(shù)對特定基因做體外的大量合成，用于以檢測DNA/RNA為目的的各種基因分析。

  PCR基因擴(kuò)增儀主要作用原理與基本計量儀器相似，對計量要素要求較高，一旦失控，儀器將不能正常工作，所以PCR基因擴(kuò)增儀也需要定期保養(yǎng)，依賴自然風(fēng)降溫的PCR基因擴(kuò)增儀尤需注意。

  在儀器的維護(hù)保養(yǎng)中需要注意的問題：

  1)PCR基因擴(kuò)增儀需要定期檢測，一般半年至少一次

  2)PCR反應(yīng)的要求溫度與實際分布的反應(yīng)溫度是不一致的，當(dāng)檢測發(fā)現(xiàn)各孔平均溫度差偏離設(shè)置溫度大于1～2℃時，可以運用溫度修正法糾正PCR實際反應(yīng)溫度差。

  3)PCR反應(yīng)過程的關(guān)鍵是升、降溫過程的時間控制，要求越短越好，當(dāng)PCR儀的降溫過程超過60s，就應(yīng)該檢查儀器的制冷系統(tǒng)，對風(fēng)冷制冷的PCR儀要較徹底地清理反應(yīng)底座的灰塵;對其他制冷系統(tǒng)應(yīng)檢查相關(guān)的制冷部件。

  4)一般情況如能采用溫度修正法糾正儀器的溫度時，不要輕易打開或調(diào)整儀器的電子控制部件，必要時要請專業(yè)人員修理或利用儀器電子線路詳細(xì)圖紙進(jìn)行維修。